科研人員還在為如何選擇核酸染料而煩惱嗎？
帶您認識幾款優秀的核酸染料

一、 李記GelRed,李記GelGreen——李記生物研發的兩款核酸染料。
據不*統計，有強烈致癌、致畸作用的EB染料仍以90%的優勢占據核酸染料使用量多，在眾多的EB替代染料中，名氣最大的要數Life公司的SYBR系列、美國Biotium公司的GelRed,GelReen染料，其他替代染料要么是EB,吖啶橙改名，要么是國內不成熟的仿品，安全性毫無保障。Life公司的SYBR Green,SYBR Goad, SYBR Safe嚴格意義上來講，不能稱作安全染料。Biotium公司的GelRed，Gelgreen是一款真正意義上的安全染料，染色效果也好，但價格奇高，做一塊50ml的瓊脂糖凝膠，染料成本接近8元！
2015年，李記生物經長期研發，開發成功國產GelRed,GelGreen染料。這兩款產品全面優于SYBR系列染料，在靈敏度、熒光強度、穩定性等方面甚至優于原創廠家Biotium公司產品（見圖1.），而價格僅為原廠2/3。
 

 
　　圖1：I、Hela細胞與SYBR Green,李記GelRed及李記GelGreen在室溫下孵育一小時，用Olympus熒光顯微鏡觀察并拍照，與SYBR Green孵育的細胞顯示出綠色熒光，表明染料已透過細胞膜進入細胞并與核酸結合。李記GelRed，李記GelGreen未顯示熒光，說明李記染料未能透過細胞膜進入細胞。 II、SYBR Green,李記GelRed及李記GelGreen染料相同DNA濃度下染色效果。
 
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二、HRM專用熒光染料 —— LyGreen
        高分辨率熔解曲線(high-resolution melting，HRM)是一種基于單核苷酸熔解溫度不同而形成不同形態熔解曲線的基因分析新技術，具有*的敏感性，可以檢測出單個堿基的差異，并且成本低、通量高、速度快、結果準確、不受檢測位點的局限，實現了真正的閉管操作。在突變掃描、單核苷酸多態性分析、甲基化研究、基因分型、序列匹配等方面HRM分析技術發揮著重要作用。
        HRM分析的一個必要條件是飽和染料，勝任這一任務的染料僅有：LC Green,SYTO 9, LyGreen等幾個產品。
        LyGreen™飽和核酸染料是一種新型的的雙鏈DNA結合飽和熒光染料，是新一代用于HRM分析的熒光染料，也可用于實時定量PCR（qPCR）。該染料結構上由兩個單體染料分子通過一個彈性臂連接成一個二聚體，在沒有dsDNA存在時，該結構呈無熒光環狀結構，一旦有dsDNA出現，則恢復隨機形態并與dsDNA結合發出強烈的綠色熒光。 與其他熒光染料如SYBR Green I 相比，LyGreen具有如下突出優點： 1）高靈敏度：在推薦濃度下使用時可以獲得比SYBR Green I 更強的信號。 2）準確：飽和結合雙鏈DNA全部小溝位置，變形時染料不遷移，熒光信號準確反映雙鏈DNA變化情況；過量染料形成二聚體，而不游離，使得LyGreen對PCR的抑制遠小于SYBR Green I，因此，使用LyGreen進行的qPCR實驗可以使用快速PCR步驟。 3）高穩定性：在正常的儲存、操作和PCR過程中不會被破壞。在緩沖溶液中的染料可以安全的儲存在室溫或冰箱里，也可以反復凍融。 4）安全性好：細胞膜穿透性測試表明，LyGreen幾乎不能穿透細胞膜，安全性高。 5）兼容性：和SYBR Green I 光譜相似，使用不同品牌qPCR儀器時不許改變光譜元件設置，也無需改變操作步驟，qPCR完成后，無需加入其它核酸染料便能直接在凝膠成像系統下觀察分析。 6）重復性好（如圖2.）：特殊設計染料，相同反應體系下，熒光信號釋放僅與雙鏈濃度有關，線性。
 
圖2.： LyGreen染料用于綿羊FecB基因HRM分析. HRM分析設備為LightCycler@480熒光定量PCR儀(德國羅氏)
 
 
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三、PikoGreen——一種極為靈敏的雙鏈DNA定量熒光染料。
       對微量的雙鏈 DNA 進行定量在各種生物學應用中都顯得非常重要,例如 cDNA 文庫的構建；用于亞克隆的 DNA 片段的純化；定量 DNA 擴增產物,在藥物中DNA 分子殘留的測定等 。
       Picogreen染料是一種dsDNA定量熒光染料，基本不受ssDNA和RNA的影響，并且可以耐受一定濃度的鹽、尿素、乙醇、氯仿、去垢劑、蛋白等干擾。目前使用Picogreen染料定量檢測DNA已經廣泛用于生物學檢測，并被2010年版《中華人民共和國藥典》選為藥物殘留DNA定量方法。但是價格貴，貨期長，假貨魚目混珠等在市場上普遍存在。
         PikoGreen是李記生物自主研發的一款新型dsDNA定量熒光染料，其檢測靈敏度高，可檢測到pg級DNA；檢測范圍寬，可跨越４個數量級；特異性好。在低檢測限，穩定性等方面全面超越PicoGreen, 是PicoGreen的替代產品，價格僅為PicoGreen的1/2. PikoGreen具有如下突出優點： 1）靈敏：數量級較UV吸光讀數更敏感，可節省樣品； 2）特異性強：只結合dsDNA，特異性強，不受樣品常規污染影響。傳統紫外吸光法容易受樣品中存在的單鏈DNA，蛋白，RNA等影響； 3）耐受性好：耐受較高濃度的鹽、尿素、乙醇、氯仿、去垢劑、蛋白或瓊脂糖，可以直接定量PCR擴增產物而無需從反應混合物中純化DNA。 4）線性范圍寬：PikoGreen dsDNA染料測定DNA濃度，在100pg/ml-100ng/ml范圍內呈良好線性；熒光計兼容。 5）容易使用：在樣品中加入染料，等待5-6分鐘染色，然后讀數即可，且適用于96和384孔板；與大多數基于熒光的酶標儀和可適用于各種DNA樣品分析，PCR的分析、芯片樣品、DNA損傷分析、酶活性分析、基因組DNA定量以及復雜混合物中dsDNA的檢測和病毒DNA定量等多種領域。 6）PikoGreen dsDNA檢測dsDNA的線性關系良好!（見圖3、圖4、圖5）
 
圖 3.PikoGreen Broad Range dsDNA （Ex/Em 350/460nm）檢測不同類型dsDNA，表現出良好線性關系。
 
圖 4.分別使用PikoGreen Broad Range dsDNA 和Quant-iT檢測calf thymus DNA，顯示 PikoGreen dsDNA 測得的 DNA 樣本線性關系更好，且動態測量范圍更廣
 
圖5. 用PikoGreen Broad Range dsDNA梯度標準calf thymus DNA溶液所做的線性回歸分析。
 
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四、李記生物研發部特別提醒：
　　在生物技術飛速發展的今天，從事分子生物學研究的科員人員幾乎每天都與核酸打交道，各種核酸染料也如食品中的味精*。不管我們對安全染料多么有信心，也不管您選擇何種EB替代產品，總之還是奉勸大家牢記----珍愛生命，請帶手套。一時半會兒看不出問題，可年輕的我們，來日方長呢！還有,各種染料染色后的廢棄試劑，請盡可能的規范處理，請做個負責任的實驗人。