EZ ECL Femto化學發光液（飛克級）

1. 取出印記膜，加入合適的封閉液在溫室下孵育20~60 min，同時振蕩，以封閉膜上非特異性蛋白結合位點。

2. 將膜從封閉液中取出，與一抗工作液在溫室孵育1 h，同時振蕩；或在28℃孵育過夜，不振蕩。

3. 將足量的洗滌緩沖液加至膜上，保證緩沖液將膜*覆蓋。振蕩孵育≥5 min，更換洗滌緩沖液并重復該步驟4~6次。增加洗滌緩沖液體積，洗滌次數和洗滌時間有助于降低背景信號。【注】：①孵育前，膜在洗滌緩沖液中的短暫淋洗會提高洗滌效率。②按前文建議的HRP標記二抗稀釋度非常重要的。

4. 將HRP標記的二抗工作液與膜在溫室孵育1 h，同時振蕩。

5. 重復步驟3，以除去未結合的HRP標記二抗。【注】：膜與HRP標記二抗孵育后必須進行*洗滌。

6. 將A溶液與B液等比例混合，制備成工作液。每cm²膜使用0.01~0.1 mL工作液，工作液可以在溫室下穩定8 h。
   【注】：暴露于日光或其他強光下可能損害工作液，為獲得最佳結果，請將此工作液保存在琥珀色瓶中光；實驗室的常見照明不會損害工作液。

7. 將印記膜在工作液中孵育5 min。從工作液中取出印記膜，并置于一個塑料片或清潔的塑料紙（膜）中，用一張吸水紙吸除多余的液體，并從印記和塑料紙之間小心地壓出氣泡。

8. 將包在塑料紙（膜）中的印記膜置于膠片暗盒中，蛋白質面朝上，除適用于膠片曝光的燈（如紅色安全燈）之外，關閉所有的燈。
   【注】：①膠片必須在曝光期間保持干燥；②確保將多余的底物從膜和塑料紙上*去除；③在整個膠片處理期間，使用手套。

9. 將X光膠片置于膜的上面。建議第一次曝光60 s。之后可調整曝光時間以達到最佳結果。化學發光反應在底物孵育后的前5~30 min期間是強烈的。這一反應可以持續幾個小時，但強度會隨時間下降，如有底物孵育后較長時間后曝光，曝光時間可能需要延長以獲得較強信號。如果使用磷光存儲成像設備（如Bio-Rad的分子成像儀系統）或CCD照相機可能需要較長的曝光時間。
   【注】：膠片與膜之間的任何移動可能在膠片上造成人為的非特異信號。

10. 使用合適的顯影劑和定影劑對膠片進行顯影。如果信號太強，則縮短曝光時間或將印記膜進行剝離并降低抗體濃度重新檢測。

1. 本產品僅限于科學實驗研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領域。

2. 為獲得最佳效果，必須優化該系統的全部組分，包括樣品量、一抗和二抗濃度以及膜和封閉試劑的類型。

3. 使用本產品比使用沉淀比色HRP底物檢測所需的抗體濃度低。為優化抗體濃度，請進行一次系統的點印跡分析。

4. 沒有一種封閉試劑對所有系統而言都是最佳的，所以為每一個免疫印跡檢測系統找到最合適的封閉緩沖液非常必需。封閉試劑有可能與抗體產生交叉反應，導致出現非特異性信號。封閉緩沖液同時也會影響系統的靈敏性。當從一種底物轉換為另一種底物時，有時會出現信號衰減或背景增加的現象，原因可能是封閉緩沖液不適合新的檢測系統。

5. 使用親和素/生*素檢測系統時，避免使用牛奶作為封閉試劑，因為牛奶中含有不定量的內源性生*素，會導致高背景信號。

6. 保證洗滌緩沖液、封閉緩沖液、抗體溶液和底物工作液的使用體積，以確保在整個實驗過程中印跡膜*被液體覆蓋，避免膜變干。增大封閉緩沖液及洗滌緩沖液的使用量可以降低非特異性的信號。

7. 為獲得最佳效果，在孵育步驟請使用搖床。

8. 將Tween20(終濃度0.05~0.1%)加入封閉緩沖液和稀釋的抗體溶液，以降低非特異信號。使用高品質的產品，如去污劑。它保存在安瓿中，過氧化物和其他雜質含量很低。

9. 不要使用疊氮鈉作為緩沖液的防腐劑。疊氮鈉是HRP的抑制。

10. 避免手與膜直接接觸，實驗過程應戴手套或使用干凈的鑷子。

11. 所有設備必須清潔且不沾染外來物質。金屬器械（如剪刀）不得具有可見的銹跡。銹跡可能導致斑點形成和高背景。

12. 底物工作液在室溫下可穩定8 h。日光或任何其他強光下可能損害底物，為獲得最佳結果，將底物工作液保存在琥珀色瓶中，并避免長期暴漏在任何強光下，短時間暴漏于實驗室常規照明不會損害該工作液。